Con los agustinos adquirió gran importancia, desarrollando una intensa labor docente en teología, humanidades, filosofía y leyes, y alcanzando el grado de Casa Capitular de la provincia de Castilla. Sus propiedades incluían los términos de Astudillo, Piteos, Mamblas y Fuentes de Año. Como muestra de su relevante papel, podemos recordar que el abad Diego Escobar, en 1566, era el capellán de la reina de Portugal. Durante el siglo XVI, se realizan los cambios más importantes en el edificio, auspiciados por el cardenal Gaspar de Quiroga, que lo amplía y modifica concediéndole además importantes obras pías. Pero si algo hace famoso al convento, es la trágica historia de la muerte de fray Luis de León, el 23 de agosto de 1591, entre estos muros, aunque recibió sepultura en Salamanca.
